增強子時空特異性地調(diào)控基因表達(dá)，對復(fù)雜性狀的形成有重要影響。因此，在人和動物的功能基因組研究中，Encyclopedia of DNA Elements （ENCODE）和Functional Annotation of Animal Genomes （FAANG）項目分別提供了大量寶貴的增強子注釋信息。但目前面臨的一個共性問題，就是如何從海量的候選增強子標(biāo)記中鑒定出影響性狀的關(guān)鍵增強子。關(guān)鍵增強子及其調(diào)控型變異的精準(zhǔn)鑒定，對畜牧領(lǐng)域中的精準(zhǔn)育種和人類醫(yī)療中致病基因的挖掘都具有重要意義。

近日，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室深圳分中心）劉毓文課題組聯(lián)合佛山鯤鵬現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院唐中林課題組在自然指數(shù)期刊《基因組研究（Genome Research）》雜志上在線發(fā)表了題為“Analyzing super-enhancer temporal dynamics reveals potential critical enhancers and their gene regulatory networks underlying skeletal muscle development”的研究論文。該研究創(chuàng)新性地提出一套分析框架，通過整合超級增強子（Super-enhancer，SE）發(fā)育時序模式、eRNA活性、基因表達(dá)、GWAS信號以及基于STARR-Seq的增強子調(diào)控型SNPs等多方面信息，精準(zhǔn)識別影響性狀的候選關(guān)鍵增強子。利用該分析框架，研究團(tuán)隊鑒定出了影響生豬產(chǎn)肉相關(guān)性狀的候選關(guān)鍵增強子及其靶基因。

該分析框架的搭建邏輯如下：首先對性狀相關(guān)組織的SEs展開發(fā)育時序模式分類，結(jié)合多組學(xué)注釋以及GWAS關(guān)聯(lián)信號富集，初步篩選出可能影響性狀的SE組成單元。SEs是由相鄰的強增強子單元所構(gòu)成，相較于普通增強子，其具備更強的調(diào)控能力與更為關(guān)鍵的生物學(xué)功能。接著，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合域（TF DNA binding motif）分析以及TFs/eRNAs/genes共表達(dá)分析，推斷出重要SE組成型增強子的上游TFs和下游靶基因，構(gòu)建出可能影響復(fù)雜性狀的增強子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。最后，結(jié)合GWAS關(guān)聯(lián)性信號和基于STARR-Seq的增強子功能性變異信息，對上述調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的候選增強子進(jìn)行過濾，從而得到在群體遺傳學(xué)水平和分子生物學(xué)水平都得到證據(jù)支持的核心增強子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。利用該分析框架，本研究產(chǎn)生了豬5個不同發(fā)育階段的骨骼肌H3K27ac增強子標(biāo)記數(shù)據(jù)，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了影響豬產(chǎn)肉相關(guān)性狀的增強子核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并對一個豬/鼠保守型增強子及其靶基因?qū)∪夥只挠绊戇M(jìn)行了基于CRISPR-Cas9的驗證。該分析框架不僅挖掘出了影響豬產(chǎn)肉相關(guān)性狀的候選關(guān)鍵增強子和靶基因，也對從增強子為切入點解析人和動物復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)帶來了新的思路。

具體來說，本研究以豬為模型，利用CUT&Tag技術(shù)繪制了骨骼肌5個關(guān)鍵發(fā)育節(jié)點（從胚胎期的初級肌纖維形成到出生后的骨骼肌發(fā)育成熟）的組蛋白H3K27ac修飾圖譜，鑒定了三個不同發(fā)育時序模式的SE家族：持續(xù)型（Con，397個）、瞬時型（TS，434個）和新生型（DN，756個）（圖1）。其中Con SEs特異聯(lián)系到肌細(xì)胞分化和骨骼肌發(fā)育過程中，而TS SEs與胚胎形態(tài)發(fā)生和血管發(fā)育有關(guān)，DN SEs與骨骼肌收縮和代謝有關(guān)。與另外兩種SEs相比，Con SEs呈現(xiàn)出更低的DNA甲基化水平以及更高的序列保守性，并且在群體遺傳學(xué)信號方面，包括產(chǎn)肉性狀GWAS信號和骨骼肌cis-eQTLs，都展現(xiàn)出更高的富集倍數(shù)。這些研究結(jié)果有力地表明，Con SEs極有可能是調(diào)控豬產(chǎn)肉性狀的核心SE子集。

圖1 豬骨骼肌SEs的發(fā)育時序模式分類

為了精準(zhǔn)確定影響產(chǎn)肉性狀的關(guān)鍵增強子，研究團(tuán)隊開發(fā)了一種新的分析框架來構(gòu)建以增強子為核心的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（如圖2所示）。該網(wǎng)絡(luò)初始骨架的構(gòu)建是基于eRNA鑒定以及TFs/eRNAs/targets共表達(dá)分析。隨后，利用與豬肉和胴體性狀相關(guān)聯(lián)的 SE eRNAs對該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行優(yōu)化。為有效排除因連鎖不平衡而產(chǎn)生混淆的GWAS信號，利用STARR-seq實驗，從增強子中的性狀關(guān)聯(lián)性SNPs中，高通量鑒定出影響增強子活性的SNPs，并基于此信息對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步過濾，并利用染色質(zhì)拓?fù)湎嚓P(guān)結(jié)構(gòu)域（Topologically associating domains，TADs）進(jìn)一步明確增強子的靶基因。最終，該研究構(gòu)建的影響產(chǎn)肉性狀的潛在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)涵蓋了30個候選關(guān)鍵增強子，其中20個源自Con SEs。這些增強子同時滿足轉(zhuǎn)錄eRNAs、關(guān)聯(lián)產(chǎn)肉性狀GWAS信號以及含有增強子調(diào)控型SNPs。

圖2 候選關(guān)鍵增強子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

接下來，研究團(tuán)隊基于豬/鼠3個層面的保守關(guān)系（DNA序列保守、表觀信號保守、共線性保守）選擇增強子在小鼠C2C12細(xì)胞中進(jìn)行成肌分化的功能驗證實驗（如圖3所示）。對20個Con型關(guān)鍵增強子在小鼠基因組上的同源序列展開分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有4個增強子滿足上述的三重保守性。其中，增強子Chr12:34230720-34231974呈現(xiàn)出最高的共線性保守，并且與一個肥胖指數(shù)GWAS SNP rs81434214相關(guān)聯(lián)。研究人員通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除了C2C12細(xì)胞中該增強子的同源序列。功能驗證實驗表明，敲除該增強子同源序列能夠顯著抑制C2C12細(xì)胞的成肌分化及其候選靶基因Akap1的表達(dá)。此外，利用siRNA降低Akap1表達(dá)也能夠顯著抑制C2C12細(xì)胞的成肌分化。這些結(jié)果作為概念驗證，證明了本研究開發(fā)的框架是挖掘影響性狀關(guān)鍵增強子的有效方法。

圖3 候選關(guān)鍵增強子的保守性分析和功能驗證

本框架挖掘關(guān)鍵增強子的重要核心模塊是等位基因特異性的STARR-Seq方法。該方法于2017年被劉毓文研究員開發(fā)，可以高通量鑒定影響增強子活性的SNP，是在GWAS和eQTL關(guān)聯(lián)性分析后，破除LD影響，精細(xì)定位調(diào)控型因果變異的有力工具。在本研究中，31%（17/55）候選關(guān)鍵增強子的調(diào)控型SNPs與PigGTEx中的豬骨骼肌cis-eQTLs重疊，且?guī)缀跞浚?6/17）位于被認(rèn)為對豬骨骼肌發(fā)育和產(chǎn)肉性狀至關(guān)重要的Con型候選關(guān)鍵增強子中。這些位點的cis-eQTL效應(yīng)和增強子調(diào)控方向一致，進(jìn)一步說明該方法可以從cis-eQTLs中精細(xì)定位功能性SNPs。此外，在群體樣本量有限導(dǎo)致cis-eQTLs檢測效力偏低的情況下，等位基因特異性的STARR-Seq可以不依賴于大量群體樣本鑒定潛在的調(diào)控型SNPs，因此，也是cis-eQTLs的重要補充。

基因組所（大鵬灣實驗室）劉毓文研究員和佛山鯤鵬現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院唐中林研究員為本研究的共同通訊作者；劉毓文課題組博士后張松（已出站）、博士生王超（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所和華中農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)博士，已畢業(yè)）和碩士生秦勝華為本文的共同第一作者。劉毓文研究員聚焦于非編碼區(qū)順式調(diào)控元件的高通量定量、功能型變異鑒定和調(diào)控語法解析，并重點應(yīng)用于生豬經(jīng)濟性狀的遺傳機制解析；唐中林研究員長期從事豬遺傳育種改良研究，為本研究提供了珍貴的組織樣品。該研究工作獲得了十四五重點研發(fā)項目和國家自然科學(xué)基金項目的支持。