近日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室深圳分中心）聯(lián)合武漢大學(xué)中南醫(yī)院在學(xué)術(shù)期刊《自然·通訊（Nature Communications）》上在線(xiàn)發(fā)表了題為“CoHIT: a one-pot ultrasensitive ERA-CRISPR system for detecting multiple same-site indels”的研究論文。該研究利用蛋白進(jìn)化和理念創(chuàng)新，實(shí)現(xiàn)對(duì)同一基因位點(diǎn)上大量不同類(lèi)型的突變（indels）進(jìn)行快速、精準(zhǔn)且簡(jiǎn)便的檢測(cè)。CoHIT檢測(cè)技術(shù)采用了一管法操作流程，從樣品準(zhǔn)備到最終結(jié)果讀取，整個(gè)過(guò)程在常溫下僅需30分鐘，且能精準(zhǔn)檢測(cè)到萬(wàn)分之一的核酸變異。該技術(shù)有望在精準(zhǔn)分子育種、食品安全監(jiān)控、傳染病早期預(yù)警、遺傳疾病篩查及腫瘤精準(zhǔn)診療等多個(gè)領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用。

精準(zhǔn)核酸檢測(cè)在疾病診斷、精準(zhǔn)醫(yī)療及農(nóng)業(yè)應(yīng)用等領(lǐng)域具有重要意義。然而，目前臨場(chǎng)快速核酸檢測(cè)方法在面對(duì)同一基因位點(diǎn)的多種indels時(shí)，往往面臨檢測(cè)覆蓋率不足的挑戰(zhàn)。為了解決這一問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)利用蛋白進(jìn)化技術(shù)篩選出具有高耐受度的Cas蛋白，并創(chuàng)新性地提出了利用單一crRNA識(shí)別多種突變類(lèi)型的理念，成功構(gòu)建了CoHIT（Cas12a-based One-for-all High-speed Isothermal Test）新型CRISPR檢測(cè)平臺(tái)。

圖1 | CoHIT檢測(cè)技術(shù)

CoHIT系統(tǒng)的核心在于一種改良的AsCas12a蛋白，即enAsU-R，它僅需一條crRNA就能靶向多個(gè)不同的變異體。通過(guò)對(duì)AsCas12a的功能區(qū)域進(jìn)行氨基酸替換，研究人員成功提高了蛋白的錯(cuò)配耐受性和PAM性能，使其能識(shí)別與crRNA序列有少量堿基錯(cuò)配的靶標(biāo)DNA。在CoHIT檢測(cè)系統(tǒng)中，Cas12a/crRNA復(fù)合體能識(shí)別并切割多個(gè)Indel變異體，從而觸發(fā)ssDNA切割活性，釋放出熒光信號(hào)，而野生型DNA則由于與crRNA識(shí)別序列的不同而無(wú)法引發(fā)熒光信號(hào)，保證了檢測(cè)的特異性。

圖2 | 對(duì)Cas12a變體進(jìn)行工程改造以提高錯(cuò)配耐受性

通過(guò)一系列參數(shù)優(yōu)化，包括緩沖液配方、反應(yīng)溫度和組分濃度調(diào)整，CoHIT技術(shù)對(duì)NPM1基因突變的常見(jiàn)亞型達(dá)到了0.01%的檢測(cè)靈敏度，且在30分鐘內(nèi)迅速給出結(jié)果，同時(shí)有效避免了野生型DNA的交叉反應(yīng)。這一特性使得CoHIT在急性髓系白血病（AML）患者NPM1突變檢測(cè)中表現(xiàn)卓越，準(zhǔn)確檢測(cè)出108名患者中的30名攜帶NPM1突變個(gè)體，且在監(jiān)測(cè)微小殘留病灶（MRD）方面展現(xiàn)了巨大的潛力。

圖3 | 使用CoHIT系統(tǒng)檢測(cè)臨床樣本和MRD

此外，通過(guò)與側(cè)向流檢測(cè)條（LFA）和微流控芯片的結(jié)合，CoHIT系統(tǒng)的適應(yīng)性和多重檢測(cè)能力得到了顯著提升，為現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)提供了可能。研究人員建立了CoHIT-LFA系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。同時(shí)，CoHIT技術(shù)與微流控裝置集成，通過(guò)一次上樣即可同時(shí)檢測(cè)7個(gè)靶標(biāo)，展示了CoHIT檢測(cè)的靈活性和多路復(fù)用潛力。

圖4 | CoHIT-LFA系統(tǒng)及基于微流控芯片的CoHIT檢測(cè)

CoHIT技術(shù)的成功研發(fā)和不斷優(yōu)化，不僅簡(jiǎn)化了檢測(cè)流程，還大大提升了檢測(cè)速度與準(zhǔn)確性，為分子育種、疾病早期診斷、遺傳病篩查和食品安全監(jiān)測(cè)等眾多領(lǐng)域提供了強(qiáng)有力的工具。

武漢大學(xué)中南醫(yī)院博士后劉銀和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所劉馨怡副研究員為該論文共同第一作者，武漢大學(xué)中南醫(yī)院周芙玲教授和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所王鑫杰研究員與李奎教授為該論文共同通訊作者。本研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、廣東省粵深聯(lián)合基金、深圳市杰出人才項(xiàng)目的支持。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-49414-7