植物環(huán)肽類物質(zhì)來源廣泛且化學(xué)結(jié)構(gòu)及生物活性多樣，具有代謝穩(wěn)定性強(qiáng)、口服利用度高的特點(diǎn)，然而不同類型植物環(huán)肽的生物合成機(jī)理多樣，石竹科-類型環(huán)肽作為植物環(huán)肽類物質(zhì)第二大類群，在抗菌、抗腫瘤等方面的活性極具開發(fā)和利用潛力。太子參（Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax,）屬于石竹科的草本植物，為典型的藥食兩用的傳統(tǒng)中藥材，具有益氣健脾、生精潤肺的功效。《中國藥典》明確規(guī)定太子參環(huán)肽B為其藥用品質(zhì)的標(biāo)志性成分，在改善神經(jīng)性損傷引起的記憶缺失和二型糖尿病等方面具有顯著作用，但其生物合成途徑尚不清楚，嚴(yán)重制約環(huán)肽類物質(zhì)的開發(fā)和利用。

近日，《植物通訊（Plant Communications）》上在線發(fā)表了中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室深圳分中心）合成生物學(xué)研究中心李偉課題組聯(lián)合福建農(nóng)林大學(xué)林文雄教授團(tuán)隊題為“Identification of a key peptide cyclase for novel cyclic peptide discovery in Pseudostellaria heterophylla”的研究論文。該研究通過多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析和底盤表達(dá)等多種合成生物手段，篩選到環(huán)肽類物質(zhì)生物合成關(guān)鍵環(huán)化酶基因，解析其切割和環(huán)化活性，闡明催化機(jī)理，并利用該關(guān)鍵酶和植物底盤發(fā)掘和合成多個太子參的新環(huán)肽。該研究突破了植物中低含量天然產(chǎn)物發(fā)掘的瓶頸，推動反向遺傳學(xué)在物質(zhì)發(fā)掘和合成生物學(xué)中的應(yīng)用。

本研究采用合成生物學(xué)研究策略，利用基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)，篩選環(huán)肽類物質(zhì)合成前體蛋白基因和環(huán)化酶基因，并借助本氏煙草瞬時表達(dá)體系、體外酶活體系及基因沉默（VIGS）體系闡明了關(guān)鍵環(huán)化酶的功能，開發(fā)了一套基于前體蛋白基因指導(dǎo)的新環(huán)肽類物質(zhì)植物底盤發(fā)掘平臺。通過化學(xué)合成的已知環(huán)肽標(biāo)準(zhǔn)品（HB/PE/PF/PG），借助中心代謝平臺的高分辨率液相質(zhì)譜（Q ExactiveTM HFX）構(gòu)建環(huán)肽類物質(zhì)檢測平臺，明確了太子參環(huán)肽類物質(zhì)在根中積累的特點(diǎn)。通過對不同組織部位候選基因的表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)2個PhOLP1基因和3個PhPCY1基因在根中高表達(dá)，環(huán)肽類物質(zhì)含量與候選基因Person相關(guān)性分析結(jié)果表明上述5個基因與之環(huán)肽類物質(zhì)含量顯著正相關(guān)。

圖1 太子參環(huán)肽類物質(zhì)合成候選基因篩選

本氏煙草瞬時表達(dá)體系共表達(dá)前體蛋白基因和候選合成酶基因，結(jié)果表明PhPCYs中的PhPCY3催化太子參環(huán)肽B的生物合成，通過原核克隆表達(dá)純化帶MBP標(biāo)簽環(huán)化酶的蛋白，合成線性的HB [14-35]、HB [14-21]底物和HB [22-35]，體外酶活實驗結(jié)果表明環(huán)化酶可以催化HB[14-35]生成HB和副產(chǎn)物HB [22-35]，但不能直接催化線性化HB[14-21]生成HB；利用太子參體內(nèi)的基因沉默（VIGS）體系沉默關(guān)鍵環(huán)化酶基因能顯著降低其基因的表達(dá)量和對應(yīng)環(huán)肽類物質(zhì)含量。

圖2 太子參環(huán)肽類物質(zhì)合成關(guān)鍵環(huán)化酶基因功能驗證

通過分子對接環(huán)化酶與不同的前體蛋白底物（PreCPs），篩選不同底物與環(huán)化酶活性中心關(guān)鍵催化位點(diǎn)，結(jié)合氨基酸序列中Prolyl oligopeptide domain序列比對分析，發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報道的環(huán)化酶關(guān)鍵三聯(lián)體（Traid）氨基酸位點(diǎn)（S/D/H）在沒有活性的PhPCY1/2蛋白中保持保守，而活性中心4?內(nèi)的N500和S502為不同底物與環(huán)化酶之間共有的關(guān)鍵活性位點(diǎn)，定點(diǎn)突變上述位點(diǎn)則能顯著降低環(huán)化酶的催化活性。

圖3 定點(diǎn)突變環(huán)化酶的關(guān)鍵催化位點(diǎn)N500和S502降低其催化活性

從不同栽培品種太子參轉(zhuǎn)錄組中篩選到環(huán)肽的前體蛋白基因110多肽條，其中100多條序列為潛在的新環(huán)肽類物質(zhì)，利用本氏煙草的植物底盤篩選到多個新的環(huán)肽類物質(zhì)，包括cyclo-[LDGPPPYF], cyclo-[WGSSTPHT],cyclo-[GLPIGAPWG] 和cyclo-[FGDVGPVI]，發(fā)掘的新環(huán)肽可用于未來生物活性的篩選和利用。

圖4 前體蛋白基因指導(dǎo)的太子參新環(huán)肽的發(fā)掘

基因組所（大鵬灣實驗室）博士后秦賢金為論文第一作者，王鳳姣博士、謝德金博士后和周齊博士參與研究項目，福建農(nóng)林大學(xué)林生教授和林文雄教授提供了太子參基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)支持，福建農(nóng)林大學(xué)林文雄教授和基因組所(大鵬灣實驗室)李偉研究員為論文的共同通訊作者，論文得到重點(diǎn)研發(fā)項目和國家自然科學(xué)基金項目的資金支持。

原文鏈接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S259034622500077X