近日，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室深圳分中心）徐煒團(tuán)隊開發(fā)了一項高通量,、低成本R-loop定量圖譜繪制技術(shù)“mDRIP-seq”,，并應(yīng)用該技術(shù)繪制了釀酒酵母突變株R-loop定量圖譜。該研究成果以“mDRIP-seq is a high-throughput method for quantitative profiling of R-loop landscape”為題在線發(fā)表于《科學(xué)通報（Science Bulletin）》（IF=18.9）,。

R-loop是由一條DNA:RNA雜合鏈和一條DNA單鏈構(gòu)成的三鏈染色質(zhì)結(jié)構(gòu),，廣泛存在于各種生物基因組中，并參與諸如基因表達(dá)調(diào)控,、DNA修復(fù)等重要生物學(xué)過程,。全基因組水平R-loop圖譜數(shù)據(jù)為R-loop的特征、生物學(xué)功能和相關(guān)調(diào)控因子的研究工作提供了重要的支持,。然而,，現(xiàn)有R-loop圖譜繪制技術(shù)通量有限，限制了R-loop生物學(xué)研究在大規(guī)模群體樣本中的展開,。

為了建立高通量R-loop圖譜繪制技術(shù),，研究團(tuán)隊通過開發(fā)單鏈條形碼標(biāo)記技術(shù)實現(xiàn)了樣本基因組DNA精確標(biāo)記，并在ssDRIP-seq技術(shù)[1]基礎(chǔ)上,，通過重構(gòu)技術(shù)流程,，最終開發(fā)出mDRIP-seq技術(shù)（圖1a）?；蚪M中R-loop含量較低,，對基因組DNA的高效率標(biāo)記是建立該技術(shù)的關(guān)鍵。為此,，團(tuán)隊開發(fā)了加尾單鏈連接技術(shù),，在保持核酸結(jié)構(gòu)完整性的前提下，可將標(biāo)簽序列高效連接到雙鏈DNA,、雜合鏈中DNA及單鏈DNA的3’端（圖1b）,。通過將多個標(biāo)記后的樣本混合在一管中，進(jìn)行同步的R-loop富集及文庫構(gòu)建操作,，mDRIP-seq技術(shù)實現(xiàn)了R-loop測序的高通量化和低成本化,。和原有技術(shù)相比,，mDRIP-seq每個樣本的文庫構(gòu)建時間降低至1/6（圖1c），平均文庫構(gòu)建成本降低至1/7（圖1d）,。

圖1 mDRIP-seq技術(shù)概況

（a）mDRIP-seq流程示意圖,；（b）加尾單鏈連接技術(shù)對雜合鏈DNA進(jìn)行標(biāo)記示意圖；（c）mDRIP-seq和ssDRIP-seq操作時長比較,；（d）mDRIP-seq和ssDRIP-seq建庫成本比較,。

mDRIP-seq中的DRIP文庫，反映了基因組中R-loop的水平,，而Input文庫反映了起始投入量的差異,。利用這兩個文庫的數(shù)據(jù)，mDRIP-seq可以簡化樣本間的定量比較（圖2a）,?；趍DRIP-seq，研究團(tuán)隊對多個物種樣本R-loop水平進(jìn)行了定量評估和比較,，并發(fā)現(xiàn)不同物種R-loop水平的差異一定程度上可以由基因密度的差異解釋（圖2b和2c）,。進(jìn)一步，研究團(tuán)隊利用該技術(shù)首次對近100種解旋酶活性和組蛋白修飾活性相關(guān)基因缺失的釀酒酵母突變株進(jìn)行了R-loop定量圖譜的繪制和分析,，揭示了這些突變株中R-loop的變化模式（圖2d）,。其中，SNF2,、SNF5,、SNF6、DEF1或NAM7等基因的缺失,，導(dǎo)致編碼蛋白基因,、逆轉(zhuǎn)座子等基因組位點R-loop水平的降低,，而缺失MED1,、RAD51或RAD52等基因的突變株呈現(xiàn)R-loop水平上升的特征（圖2d）。酵母突變株R-loop圖譜集的繪制,，為R-loop調(diào)控因子及調(diào)控機理的研究提供了重要的數(shù)據(jù)支持,。

圖2 mDRIP-seq技術(shù)的應(yīng)用

（a）mDRIP-seq對HEK293T不同投入量gDNA的R-loop水平進(jìn)行定量；（b）mDRIP-seq對不同物種樣本R-loop進(jìn)行定量,；（c）R-loop含量和基因密度的相關(guān)性,；（d）酵母突變株R-loop變化熱圖。

該研究開發(fā)的mDRIP-seq技術(shù),，為R-loop全基因組水平研究提供了一種高效便捷的技術(shù)工具,，并將推動R-loop研究工作在農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的進(jìn)一步拓展,。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所徐煒研究員為論文的通訊作者,，基因組所博士后孫長斌為論文的第一作者,，基因組所科研助理王珍珍、清華大學(xué)李沁博士及孫前文副教授為該工作提供了幫助,。該研究得到了中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年創(chuàng)新專項,、國家自然科學(xué)基金、中國博士后科學(xué)基金以及國家重點研發(fā)計劃的支持,。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.scib.2024.05.023

參考文獻(xiàn)：

1. Xu W, Xu H, Li K, Fan Y, Liu Y, Yang X, Sun Q: The R-loop is a common chromatin feature of the Arabidopsis genome. Nature plants 2017, 3(9):704-714.