基因編輯技術(shù)存在的脫靶效應是影響其能否廣泛應用的主要限制因素,。近日，《自然—方法學》在線發(fā)表中國農(nóng)業(yè)科學院深圳基因組研究所、中科院神經(jīng)科學研究所與中科院馬普計算生物學伙伴研究所合作的最新成果。他們根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)預測了基因編輯過程中決定脫靶效應的重要氨基酸，并在不影響催化活性的情況下突變相應氨基酸,，最終得到了顯著降低基因編輯脫靶效應的單堿基編輯工具。

　　GOTI技術(shù)的延伸

　　2019年3月,，該團隊曾在《科學》發(fā)布用于檢測基因編輯技術(shù)脫靶率的GOTI技術(shù),。論文共同通訊作者、中國農(nóng)業(yè)科學院深圳基因組研究所研究員左二偉告訴《中國科學報》,，這項最新成果即為基于GOTI技術(shù)探索解決單堿基編輯器脫靶效應的方法,。

　　目前，以CRISPR/Cas9 系統(tǒng)為核心的基因編輯工具被廣泛應用于造血干細胞,、神經(jīng)細胞等醫(yī)學研究領(lǐng)域,。

　　“傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)要切斷DNA雙鏈，這給基因編輯結(jié)果帶來了一定的不確定性,?！弊蠖フf,，其衍生工具——單堿基編輯技術(shù)可以在不切斷DNA雙鏈的情況下實現(xiàn)單核苷酸的定向突變?！斑@為治療單堿基突變引起的遺傳性疾病帶來了希望,。”

　　GOTI技術(shù)是全新一代基因編輯脫靶檢測技術(shù),，該技術(shù)在靈敏性,、準確性和適用范圍上遠超之前的脫靶檢測技術(shù)。

　　“有了GOTI技術(shù)以后才能準確評價基因編輯技術(shù)的安全性,?！闭撐墓餐ㄓ嵶髡摺⒅锌圃荷虾Ｉ窠?jīng)科學研究所研究員楊輝告訴《中國科學報》,，在此基礎(chǔ)上才能有目的地去改進已有的單堿基編輯工具或開發(fā)新的編輯工具,。

　　管住任性的脫氨酶

　　單堿基編輯工具是人類根據(jù)蛋白工程設(shè)計、以氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)分子,，該系統(tǒng)由脫氨酶和nCas9等組件構(gòu)成融合蛋白發(fā)揮功能。左二偉介紹,，利用GOTI技術(shù),，他們發(fā)現(xiàn)胞嘧啶脫氨酶單堿基編輯技術(shù)（CBE）的脫靶是由胞嘧啶脫氨酶造成的。

　　“脫氨酶在編輯工具中扮演著催化的角色,。它本來應該在sgRNA帶領(lǐng)下,，按照堿基配對規(guī)律，使Cas9蛋白結(jié)合到基因組相應位置上,，對單堿基進行轉(zhuǎn)化,。但脫氨酶本身具有ssDNA和RNA結(jié)合能力，它會帶著Cas9蛋白在任意‘喜歡’的位點引發(fā)堿基突變,?！弊蠖フf，這是一種完全隨機無法預測的脫靶效應,。

　　找到了CBE脫靶的原因,，該團隊即開始著手改進單堿基編輯工具。

　　論文共同通訊作者,、中科院馬普計算生物學伙伴研究所研究員李亦學在接受《中國科學報》采訪時說,，在脫靶效應檢測中，計算生物學能提供詳細的計算方法和模式,，從而通過分析實驗數(shù)據(jù)快速獲得結(jié)論,，分析脫靶的程度和危害。

　　而在改進單堿基編輯工具時,，計算生物學則發(fā)揮了強大的運算能力：利用高通量的生物信息學手段來篩選脫氨酶改造的目的位點,。

　　“我們利用同源序列比對的方法，預測了結(jié)構(gòu)未知的脫氨酶與ssDNA或RNA結(jié)合的區(qū)域，并在這個區(qū)域的重要氨基酸上引入了特定的突變,。通過改變蛋白構(gòu)象,，消除了脫氨酶與ssDNA或RNA的結(jié)合能力?！闭撐墓餐谝蛔髡?、中科院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心博士孫怡迪告訴《中國科學報》。

　　研究人員一共構(gòu)建了23個CBE突變體,，并全面檢測了突變體是否存在全基因范圍內(nèi)的脫靶,，發(fā)現(xiàn)其中4個突變體不會影響基因編輯效率，還能夠降低隨機脫靶效應,。

　　“我們優(yōu)化了上述CBE突變體,，增加標簽和核定位序列，在高保真的情況下,，顯著提高了基因編輯效率,，從而使其成為既安全又高效的新的基因編輯工具YE1-BE3-FNLS?！睏钶x說,，這一新工具有望應用于遺傳疾病基因治療，推動基因編輯臨床化應用,。

　　實現(xiàn)商業(yè)化還有很長的路

　　“我們希望GOTI技術(shù)能成為用于檢測基因編輯脫靶的金標準,。”楊輝說,，無論是基因編輯技術(shù)的科學研究,，還是遺傳病的基因療法，都應該用高效準確的方法去評估其安全性,，也就是脫靶效應,。

　　“在實驗室階段還是比較容易實現(xiàn)GOTI技術(shù)的。但應用于臨床,，還有很多優(yōu)化和降低成本的工作要做,。真正實現(xiàn)商業(yè)化，還有很長的一段路要走,?！崩钜鄬W說。

　　左二偉認為,，新的單堿基編輯工具對于基因治療中常用的載體腺相關(guān)病毒來說,，“體積有點大”，這是未來需要改進的地方,。

　　“這項技術(shù)需要直接消化掉小鼠整個發(fā)育良好的胚胎,，這種操作很難用在人的身上,。”孫怡迪說,，新的基因編輯技術(shù)如何實現(xiàn)無創(chuàng)傷檢測,，是一件值得思考的事。

　　楊輝則強調(diào),，目前對脫靶效應的檢測,、對單堿基編輯工具的改進等，都是在實驗室完成的,，“已經(jīng)解決了基因編輯技術(shù)的安全性和有效性問題”,，而基因治療的安全性和有效性尚待動物實驗和臨床試驗進一步驗證。

　　相關(guān)論文信息：https://doi.org/10.1038/s41592-020-0832-x

　　《中國科學報》 (2020-06-24 第4版 綜合)