2024年6月3日,，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室深圳分中心）左二偉課題組在《自然生物醫(yī)學(xué)工程（Nature Biomedical Engineering）》上發(fā)表了題為“Structure-guided discovery of highly efficient cytidine deaminases with sequence-context independence”的研究論文,。該研究創(chuàng)新性地運(yùn)用AlphaFold2介導(dǎo)的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測和結(jié)構(gòu)相似性聚類方法來挖掘新型胞嘧啶脫氨酶,，并開發(fā)了高效,、無序列偏好性的胞嘧啶堿基編輯工具。

挖掘新的功能性蛋白在生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)應(yīng)用等方面具有重要意義,。傳統(tǒng)的挖掘主要依賴于蛋白質(zhì)的一級(jí)序列信息,，通過一級(jí)序列相似性比對(duì)和分類來篩選新的特定功能蛋白。然而,，這種方式忽略了決定蛋白質(zhì)功能的三維結(jié)構(gòu)信息,，因此降低了篩選的效率和準(zhǔn)確性。蛋白三維結(jié)構(gòu)信息有助于開展新功能蛋白的挖掘工作,。在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測工具之前,，三維結(jié)構(gòu)信息主要通過冷凍電鏡、X-射線和核磁共振等方法獲取,，這些需要耗費(fèi)大量人力和時(shí)間成本,，不適合開展大規(guī)模的蛋白發(fā)掘工作。近年來發(fā)展的以AlphaFold2為代表的人工智能（Artificial Intelligence, AI）技術(shù)可以快速的對(duì)給定的蛋白序列進(jìn)行高精度三維結(jié)構(gòu)預(yù)測,。利用AlphaFold2對(duì)蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行大規(guī)模解析和聚類將極大推動(dòng)新功能蛋白的挖掘效率,。

胞嘧啶脫氨酶，如載脂蛋白B mRNA催化編輯蛋白酶（APOBEC）和激活誘導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基化酶（AID）,，是催化基因組DNA中C堿基脫氨為U堿基并誘導(dǎo)單堿基替換的基因編輯酶,。科研人員利用大鼠APOBEC1（rAPOBEC1）,、人APOBEC3A（hAPOBEC3A）和人AID（hAID）等構(gòu)建了多種胞嘧啶堿基編輯器（CBE）,。雖然通過各種工程進(jìn)化手段可以優(yōu)化脫氨酶的編輯性能，但受制于脫氨酶的原有序列基礎(chǔ),，優(yōu)化后的脫氨酶在某些方面的編輯特性仍存在缺陷,。比如，不能兼顧高編輯效率和低脫靶效應(yīng),，誘導(dǎo)產(chǎn)生較多indels,，C-to-G的編輯效率和編輯純度較低等,。更重要的是,，現(xiàn)有的編輯器都具有明顯的序列偏好性，目前缺乏可以對(duì)任意NC基序（AC/TC/CC/GC）無完全偏好的胞嘧啶脫氨酶,，極大的限制了CBE在某些重要位點(diǎn)的編輯效率,。因此，發(fā)掘具有新功能特性的胞嘧啶脫氨酶對(duì)于升級(jí)和擴(kuò)展CBE的編輯能力具有重要意義,。

圖 基于AlphaFold2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測和結(jié)構(gòu)相似性聚類的方法深度挖掘新型胞嘧啶脫氨酶

在這項(xiàng)研究中,，科研人員使用AlphaFold2預(yù)測了1483個(gè)胞苷脫氨酶的三維結(jié)構(gòu)，根據(jù)結(jié)構(gòu)相似性對(duì)這些脫氨酶進(jìn)行聚類，并從聚類中選擇具有代表性的272個(gè)脫氨酶進(jìn)行堿基編輯活性檢測,。通過這種方法,，科研人員篩選到了多種具有鮮明特征性的脫氨酶。在HEK293T細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,，這些代表性的脫氨酶表現(xiàn)出多種獨(dú)特的編輯特征,。比如，有的具有超高的C-to-T編輯活性,，有的具有高編輯特異性（編輯效率和脫靶效應(yīng)的比值）,，有的具有多樣性的編輯窗口。最有意思的是,，科研人員發(fā)現(xiàn)了幾種對(duì)編輯位點(diǎn)序列無偏好性的胞嘧啶脫氨酶,，它們對(duì)靶位點(diǎn)的不同基序（AC/GC/TC/CC）表現(xiàn)出無選擇偏好性編輯。此外,，通過蛋白/DNA互作模型,，科研人員在候選脫氨酶上預(yù)測了多個(gè)影響單鏈DNA結(jié)合能力的氨基酸殘基位點(diǎn)，對(duì)這些位點(diǎn)的突變進(jìn)一步降低了脫氨酶的脫靶效應(yīng),。

科研人員還在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞（人HEK293T,、小鼠N2A、小鼠mESCs和豬PK-15）基因組的內(nèi)源性位點(diǎn)上檢測了CBE的編輯效果,。結(jié)果顯示,，新開發(fā)的CBE可以對(duì)這些哺乳動(dòng)物細(xì)胞的單拷貝或多拷貝基因進(jìn)行高效的C-to-T編輯，并誘導(dǎo)產(chǎn)生終止密碼子,。此外,，優(yōu)化后的胞嘧啶脫氨酶還可與多種Cas蛋白（nSpCas9、nSpCas9-NG,、nSaCas9和dCpf1）兼容,，極大的提高了CBE的靶向范圍和編輯產(chǎn)物純度。這項(xiàng)研究顯示出基于AI的蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測工具在挖掘和篩選新功能蛋白的方面的巨大潛力,，并提供了高效率,、適用廣泛的候選胞嘧啶脫氨酶用于構(gòu)建CBE工具，有力推進(jìn)CBE的生物醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)育種上等方面的應(yīng)用,。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所左二偉課題組博士后徐奎,、馮虎、張海航,、賀晨飛和博士生康會(huì)芳為論文共同第一作者,；左二偉研究員為論文通訊作者。本研究得到了科技創(chuàng)新2030—重大項(xiàng)目,、國家自然科學(xué)基金,、博士后科學(xué)基金和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程等資助,。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41551-024-01220-8