2024年6月3日，中國農(nóng)業(yè)科學院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術廣東省實驗室深圳分中心）左二偉課題組在《自然生物醫(yī)學工程（Nature Biomedical Engineering）》上發(fā)表了題為“Structure-guided discovery of highly efficient cytidine deaminases with sequence-context independence”的研究論文。該研究創(chuàng)新性地運用AlphaFold2介導的蛋白結構預測和結構相似性聚類方法來挖掘新型胞嘧啶脫氨酶，并開發(fā)了高效、無序列偏好性的胞嘧啶堿基編輯工具。

挖掘新的功能性蛋白在生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)應用等方面具有重要意義。傳統(tǒng)的挖掘主要依賴于蛋白質的一級序列信息，通過一級序列相似性比對和分類來篩選新的特定功能蛋白。然而，這種方式忽略了決定蛋白質功能的三維結構信息，因此降低了篩選的效率和準確性。蛋白三維結構信息有助于開展新功能蛋白的挖掘工作。在蛋白質三維結構預測工具之前，三維結構信息主要通過冷凍電鏡、X-射線和核磁共振等方法獲取，這些需要耗費大量人力和時間成本，不適合開展大規(guī)模的蛋白發(fā)掘工作。近年來發(fā)展的以AlphaFold2為代表的人工智能（Artificial Intelligence, AI）技術可以快速的對給定的蛋白序列進行高精度三維結構預測。利用AlphaFold2對蛋白三維結構進行大規(guī)模解析和聚類將極大推動新功能蛋白的挖掘效率。

胞嘧啶脫氨酶，如載脂蛋白B mRNA催化編輯蛋白酶（APOBEC）和激活誘導的胞嘧啶脫氨基化酶（AID），是催化基因組DNA中C堿基脫氨為U堿基并誘導單堿基替換的基因編輯酶。科研人員利用大鼠APOBEC1（rAPOBEC1）、人APOBEC3A（hAPOBEC3A）和人AID（hAID）等構建了多種胞嘧啶堿基編輯器（CBE）。雖然通過各種工程進化手段可以優(yōu)化脫氨酶的編輯性能，但受制于脫氨酶的原有序列基礎，優(yōu)化后的脫氨酶在某些方面的編輯特性仍存在缺陷。比如，不能兼顧高編輯效率和低脫靶效應，誘導產(chǎn)生較多indels，C-to-G的編輯效率和編輯純度較低等。更重要的是，現(xiàn)有的編輯器都具有明顯的序列偏好性，目前缺乏可以對任意NC基序（AC/TC/CC/GC）無完全偏好的胞嘧啶脫氨酶，極大的限制了CBE在某些重要位點的編輯效率。因此，發(fā)掘具有新功能特性的胞嘧啶脫氨酶對于升級和擴展CBE的編輯能力具有重要意義。

圖 基于AlphaFold2蛋白結構預測和結構相似性聚類的方法深度挖掘新型胞嘧啶脫氨酶

在這項研究中，科研人員使用AlphaFold2預測了1483個胞苷脫氨酶的三維結構，根據(jù)結構相似性對這些脫氨酶進行聚類，并從聚類中選擇具有代表性的272個脫氨酶進行堿基編輯活性檢測。通過這種方法，科研人員篩選到了多種具有鮮明特征性的脫氨酶。在HEK293T細胞中的實驗結果顯示，這些代表性的脫氨酶表現(xiàn)出多種獨特的編輯特征。比如，有的具有超高的C-to-T編輯活性，有的具有高編輯特異性（編輯效率和脫靶效應的比值），有的具有多樣性的編輯窗口。最有意思的是，科研人員發(fā)現(xiàn)了幾種對編輯位點序列無偏好性的胞嘧啶脫氨酶，它們對靶位點的不同基序（AC/GC/TC/CC）表現(xiàn)出無選擇偏好性編輯。此外，通過蛋白/DNA互作模型，科研人員在候選脫氨酶上預測了多個影響單鏈DNA結合能力的氨基酸殘基位點，對這些位點的突變進一步降低了脫氨酶的脫靶效應。

科研人員還在多種哺乳動物細胞（人HEK293T、小鼠N2A、小鼠mESCs和豬PK-15）基因組的內(nèi)源性位點上檢測了CBE的編輯效果。結果顯示，新開發(fā)的CBE可以對這些哺乳動物細胞的單拷貝或多拷貝基因進行高效的C-to-T編輯，并誘導產(chǎn)生終止密碼子。此外，優(yōu)化后的胞嘧啶脫氨酶還可與多種Cas蛋白（nSpCas9、nSpCas9-NG、nSaCas9和dCpf1）兼容，極大的提高了CBE的靶向范圍和編輯產(chǎn)物純度。這項研究顯示出基于AI的蛋白結構預測工具在挖掘和篩選新功能蛋白的方面的巨大潛力，并提供了高效率、適用廣泛的候選胞嘧啶脫氨酶用于構建CBE工具，有力推進CBE的生物醫(yī)學和農(nóng)業(yè)育種上等方面的應用。

中國農(nóng)業(yè)科學院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所左二偉課題組博士后徐奎、馮虎、張海航、賀晨飛和博士生康會芳為論文共同第一作者；左二偉研究員為論文通訊作者。本研究得到了科技創(chuàng)新2030—重大項目、國家自然科學基金、博士后科學基金和中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程等資助。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41551-024-01220-8