近日，中國農業(yè)科學院深圳農業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農業(yè)科學與技術廣東省實驗室深圳分中心）徐煒課題組聯(lián)合清華大學孫前文課題組與孟安明課題組開發(fā)了一項高精度、超微量R-loop定量測序技術ULI-ssDRIP-seq，并基于該項技術揭示了R-loop在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的基因組動態(tài)分布模式及生物學功能。該研究成果以“ULI-ssDRIP-seq revealed R-loop dynamics during vertebrate early embryogenesis”為題在線發(fā)表于《細胞洞察（Cell Insight）》。

R-loop由一條DNA:RNA互補雜合雙鏈及另一條未配對的DNA單鏈構成，廣泛存在于從原核生物到人類的各物種基因組中，并通過調控基因表達、DNA損傷與修復、基因組表觀遺傳學修飾等重要生物學過程影響著生命體的各種活動。在斑馬魚（Danio rerio）中，R-loop可以通過影響tRNA基因轉錄對早期胚胎發(fā)育過程進行調控[1]，還參與胚胎神經(jīng)元[2]、造血干/祖細胞（HSPCs）的發(fā)育調控[3]。親本-合子轉變（Parental to zygotic transition）是早期發(fā)育的第一個關鍵事件，主要由母源mRNA降解和合子基因組激活（ZGA）介導。以往的研究顯示，組蛋白修飾等表觀遺傳因子在親本-合子轉變過程中發(fā)生了廣泛的重編程[4]。但R-loop在脊椎動物早期胚胎發(fā)育過程中的動態(tài)變化模式之前未見報道，主要原因是原先的各類R-loop測序技術靈敏度有限，無法用于細胞數(shù)極少的超微量樣本。

為了解決上述問題，研究團隊基于高效單鏈DNA接頭預先連接方案，通過重構技術流程，實現(xiàn)了一管式建庫，大幅減少了樣本損失，最終成功開發(fā)出了超高分辨率、超微量R-loop測序技術ULI-ssDRIP-seq（圖1A）。該項技術將細胞需求量降低至1000個，并且將分辨率提升至接近單核苷酸水平。進一步，研究團隊通過引入異源gDNA作為spike-in對照，結合R-loop文庫與input文庫數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了對R-loop的定量檢測（圖1B）。

圖1 ULI-ssDRIP-seq技術概況

（a）ULI-ssDRIP-seq流程示意圖；（b）ULI-ssDRIP-seq定量分析流程示意圖。

研究團隊使用ULI-ssDRIP-seq繪制了斑馬魚從配子到早期胚胎的R-loop動態(tài)變化圖譜（圖2A），并通過數(shù)據(jù)分析揭示了R-loop在早期胚胎發(fā)育過程中的動態(tài)變化模式。數(shù)據(jù)顯示，穹頂期胚胎上調的R-loop顯著富集于增強子區(qū)域，表明R-loop有可能參與增強子介導的ZGA過程（圖2B）。為了證明該猜想，研究團隊基于dCas9系統(tǒng)，結合R-loop特異性水解酶RNase H1，開發(fā)了適用于斑馬魚的R-loop靶向編輯系統(tǒng)。通過R-loop靶向編輯系統(tǒng)下調重要合子基因sox3或has2上游增強子的R-loop水平后，可以分別造成這兩個基因的表達下降，證明R-loop確實參與了合子基因激活過程的調控。進一步實驗證明，通過敲低或過表達RNase H1來上調或下調全基因組R-loop水平均會導致胚胎發(fā)育延遲，并使基因表達模式發(fā)生顯著變化（圖2C）。其中，上調R-loop引起的胚胎發(fā)育受阻現(xiàn)象尤為明顯，并且這個過程是依賴于p53途徑的。綜上所述，該研究構建了首個脊椎動物親本-合子轉變過程中的R-loop動態(tài)圖譜，并揭示了穩(wěn)定的R-loop動態(tài)變化模式在維持早期胚胎正常發(fā)育過程中的功能。

圖2 R-loop在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的動態(tài)分布及功能研究

（a）所檢測各時期胚胎樣本示意圖；（b）256細胞時期及穹頂期胚胎ULI-ssDRIP-seq及RNA-seq信號IGV截圖，圖中展示了has2基因及上游增強子區(qū)域。

中國農業(yè)科學院深圳農業(yè)基因組研究所徐煒研究員、清華大學博士生劉鑫、基因組所博士生李謹謹、博士后孫長斌、清華大學陳露西博士為論文的共同第一作者。清華大學孫前文副教授、孟安明院士、基因組所徐煒研究員為共同通訊作者。該工作也得到了清華大學周勁聰博士、李寬博士及李沁博士的幫助。該研究工作得到了國家自然科學基金、中國農業(yè)科學院青年創(chuàng)新專項以及國家重點研發(fā)計劃的支持。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cellin.2024.100179

參考文獻：

1.Chen L, Xu W, Liu K, Jiang Z, Han Y, Jin H, Zhang L, Shen W, Jia S, Sun Q et al. 5' Half of specific tRNAs feeds back to promote corresponding tRNA gene transcription in vertebrate embryos. Science Advances 2021, 7(47):eabh0494.

2. Sorrells S, Nik S, Casey MJ, Cameron RC, Truong H, Toruno C, Gulfo M, Lowe A, Jette C, Stewart RA et al. Spliceosomal components protect embryonic neurons from R-loop-mediated DNA damage and apoptosis. Disease models & mechanisms 2018, 11(2).

3. Weinreb JT, Ghazale N, Pradhan K, Gupta V, Potts KS, Tricomi B, Daniels NJ, Padgett RA, De Oliveira S, Verma A et al. Excessive R-loops trigger an inflammatory cascade leading to increased HSPC production. Developmental cell 2021, 56(5):627-640 e625.

4. Zhang B, Wu X, Zhang W, Shen W, Sun Q, Liu K, Zhang Y, Wang Q, Li Y, Meng A et al. Widespread Enhancer Dememorization and Promoter Priming during Parental-to-Zygotic Transition. Molecular cell 2018, 72(4):673-686 e676