近日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室深圳分中心）徐煒課題組聯(lián)合清華大學(xué)孫前文課題組與孟安明課題組開發(fā)了一項(xiàng)高精度,、超微量R-loop定量測(cè)序技術(shù)ULI-ssDRIP-seq,，并基于該項(xiàng)技術(shù)揭示了R-loop在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的基因組動(dòng)態(tài)分布模式及生物學(xué)功能,。該研究成果以“ULI-ssDRIP-seq revealed R-loop dynamics during vertebrate early embryogenesis”為題在線發(fā)表于《細(xì)胞洞察（Cell Insight）》,。

R-loop由一條DNA:RNA互補(bǔ)雜合雙鏈及另一條未配對(duì)的DNA單鏈構(gòu)成,，廣泛存在于從原核生物到人類的各物種基因組中,，并通過調(diào)控基因表達(dá),、DNA損傷與修復(fù),、基因組表觀遺傳學(xué)修飾等重要生物學(xué)過程影響著生命體的各種活動(dòng),。在斑馬魚（Danio rerio）中，R-loop可以通過影響tRNA基因轉(zhuǎn)錄對(duì)早期胚胎發(fā)育過程進(jìn)行調(diào)控[1],，還參與胚胎神經(jīng)元[2],、造血干/祖細(xì)胞（HSPCs）的發(fā)育調(diào)控[3]。親本-合子轉(zhuǎn)變（Parental to zygotic transition）是早期發(fā)育的第一個(gè)關(guān)鍵事件,，主要由母源mRNA降解和合子基因組激活（ZGA）介導(dǎo),。以往的研究顯示，組蛋白修飾等表觀遺傳因子在親本-合子轉(zhuǎn)變過程中發(fā)生了廣泛的重編程[4],。但R-loop在脊椎動(dòng)物早期胚胎發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)變化模式之前未見報(bào)道,，主要原因是原先的各類R-loop測(cè)序技術(shù)靈敏度有限，無法用于細(xì)胞數(shù)極少的超微量樣本,。

為了解決上述問題,，研究團(tuán)隊(duì)基于高效單鏈DNA接頭預(yù)先連接方案，通過重構(gòu)技術(shù)流程,，實(shí)現(xiàn)了一管式建庫(kù),，大幅減少了樣本損失，最終成功開發(fā)出了超高分辨率,、超微量R-loop測(cè)序技術(shù)ULI-ssDRIP-seq（圖1A）,。該項(xiàng)技術(shù)將細(xì)胞需求量降低至1000個(gè)，并且將分辨率提升至接近單核苷酸水平,。進(jìn)一步,，研究團(tuán)隊(duì)通過引入異源gDNA作為spike-in對(duì)照，結(jié)合R-loop文庫(kù)與input文庫(kù)數(shù)據(jù),，實(shí)現(xiàn)了對(duì)R-loop的定量檢測(cè)（圖1B）,。

圖1 ULI-ssDRIP-seq技術(shù)概況

（a）ULI-ssDRIP-seq流程示意圖；（b）ULI-ssDRIP-seq定量分析流程示意圖,。

研究團(tuán)隊(duì)使用ULI-ssDRIP-seq繪制了斑馬魚從配子到早期胚胎的R-loop動(dòng)態(tài)變化圖譜（圖2A）,，并通過數(shù)據(jù)分析揭示了R-loop在早期胚胎發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)變化模式。數(shù)據(jù)顯示,，穹頂期胚胎上調(diào)的R-loop顯著富集于增強(qiáng)子區(qū)域,，表明R-loop有可能參與增強(qiáng)子介導(dǎo)的ZGA過程（圖2B）。為了證明該猜想，研究團(tuán)隊(duì)基于dCas9系統(tǒng),，結(jié)合R-loop特異性水解酶RNase H1,，開發(fā)了適用于斑馬魚的R-loop靶向編輯系統(tǒng)。通過R-loop靶向編輯系統(tǒng)下調(diào)重要合子基因sox3或has2上游增強(qiáng)子的R-loop水平后,，可以分別造成這兩個(gè)基因的表達(dá)下降,，證明R-loop確實(shí)參與了合子基因激活過程的調(diào)控。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明,，通過敲低或過表達(dá)RNase H1來上調(diào)或下調(diào)全基因組R-loop水平均會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育延遲,，并使基因表達(dá)模式發(fā)生顯著變化（圖2C）。其中,，上調(diào)R-loop引起的胚胎發(fā)育受阻現(xiàn)象尤為明顯,，并且這個(gè)過程是依賴于p53途徑的。綜上所述,，該研究構(gòu)建了首個(gè)脊椎動(dòng)物親本-合子轉(zhuǎn)變過程中的R-loop動(dòng)態(tài)圖譜,，并揭示了穩(wěn)定的R-loop動(dòng)態(tài)變化模式在維持早期胚胎正常發(fā)育過程中的功能,。

圖2 R-loop在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)分布及功能研究

（a）所檢測(cè)各時(shí)期胚胎樣本示意圖,；（b）256細(xì)胞時(shí)期及穹頂期胚胎ULI-ssDRIP-seq及RNA-seq信號(hào)IGV截圖，圖中展示了has2基因及上游增強(qiáng)子區(qū)域,。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所徐煒研究員,、清華大學(xué)博士生劉鑫、基因組所博士生李謹(jǐn)謹(jǐn),、博士后孫長(zhǎng)斌,、清華大學(xué)陳露西博士為論文的共同第一作者。清華大學(xué)孫前文副教授,、孟安明院士,、基因組所徐煒研究員為共同通訊作者。該工作也得到了清華大學(xué)周勁聰博士,、李寬博士及李沁博士的幫助,。該研究工作得到了國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年創(chuàng)新專項(xiàng)以及國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃的支持,。

原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cellin.2024.100179

參考文獻(xiàn)：

1.Chen L, Xu W, Liu K, Jiang Z, Han Y, Jin H, Zhang L, Shen W, Jia S, Sun Q et al. 5' Half of specific tRNAs feeds back to promote corresponding tRNA gene transcription in vertebrate embryos. Science Advances 2021, 7(47):eabh0494.

2. Sorrells S, Nik S, Casey MJ, Cameron RC, Truong H, Toruno C, Gulfo M, Lowe A, Jette C, Stewart RA et al. Spliceosomal components protect embryonic neurons from R-loop-mediated DNA damage and apoptosis. Disease models & mechanisms 2018, 11(2).

3. Weinreb JT, Ghazale N, Pradhan K, Gupta V, Potts KS, Tricomi B, Daniels NJ, Padgett RA, De Oliveira S, Verma A et al. Excessive R-loops trigger an inflammatory cascade leading to increased HSPC production. Developmental cell 2021, 56(5):627-640 e625.

4. Zhang B, Wu X, Zhang W, Shen W, Sun Q, Liu K, Zhang Y, Wang Q, Li Y, Meng A et al. Widespread Enhancer Dememorization and Promoter Priming during Parental-to-Zygotic Transition. Molecular cell 2018, 72(4):673-686 e676