近日，中國農(nóng)業(yè)科學院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學與技術(shù)廣東省實驗室深圳分中心，以下簡稱“基因組所”）蕭玉濤團隊在《公共科學圖書館-生物學（PLoS Biology）》在線發(fā)表了題為“Retrotransposon-mediated disruption of a chitin synthase gene confers insect resistance to Bacillus thuringiensis Vip3Aa toxin”的研究論文。該研究發(fā)現(xiàn)了一個極為重要的Vip抗性基因。該研究首次證實，中腸幾丁質(zhì)合成酶（Chitin synthase 2, CHS2）變異參與介導了草地貪夜蛾對Vip3Aa的高水平抗性。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis, Bt）產(chǎn)生的殺蟲蛋白已被廣泛應(yīng)用于害蟲防治近一個世紀，有效保護了作物免受蟲害。然而，Bt作物長年大規(guī)模的種植，不可避免地導致靶標害蟲對其演化出抗性。目前，已報道害蟲對轉(zhuǎn)Bt-Cry蛋白作物產(chǎn)生田間抗性（practical resistance）案例不低于26例，分布于7個國家，包含11種靶標害蟲。為了對抗害蟲對Cry蛋白的抗性，農(nóng)民開始種植同時產(chǎn)生Cry蛋白和Vip3Aa的轉(zhuǎn)基因作物。Vip3Aa蛋白是Bt在營養(yǎng)階段產(chǎn)生的殺蟲蛋白，擁有較好的殺蟲功效，且與Cry蛋白的殺蟲作用模式不同。

近年來，鱗翅目害蟲美洲棉鈴蟲（Helicoverpa zea）和草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）對Vip3Aa具有田間抗性的早期預警已有報道。因此，迫切需要了解靶標害蟲對Vip3Aa產(chǎn)生抗性的遺傳基礎(chǔ)，用于田間抗性監(jiān)測和管理。這對于全球重要入侵害蟲草地貪夜蛾尤為重要，該害蟲自2018年底由云南邊境入侵我國，目前已將其分布范圍從美洲擴展到非洲、亞洲和澳大利亞。它較強的適應(yīng)性、繁殖能力以及遠距離遷徙能力對入侵地農(nóng)作物的安全生產(chǎn)造成嚴重威脅。

研究人員首先采集了草地貪夜蛾田間種群，通過室內(nèi)連續(xù)篩選，獲得了抗性穩(wěn)定遺傳的Vip3Aa抗性品系（Sfru_R3）。生物測定結(jié)果表明，該抗性品系擁有相對于敏感品系約5,560倍的Vip3Aa抗性，且與Cry毒素（Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa）不存在交互抗性。遺傳特征分析結(jié)果表明，該抗性性狀為常染色體、不完全隱性遺傳，且由單遺傳位點控制。為了明確介導該抗性的遺傳基礎(chǔ)，研究人員首先構(gòu)建了F2性狀分離群體，通過BSA（bulked segregant analysis）定位到位于1號染色體上長度約為4.4 Mb（6.56-10.92 Mb）的遺傳區(qū)間（圖1）。在此基礎(chǔ)上，進一步通過精細定位（fine-mapping），將候選遺傳區(qū)間縮小至0.75 Mb（8.17-8.62 Mb）。該候選遺傳區(qū)間內(nèi)共有19個基因被注釋，結(jié)合這19個基因的轉(zhuǎn)錄水平及其蛋白結(jié)構(gòu)，最終將目標基因鎖定為SfCHS2。目標基因為幾丁質(zhì)合成酶基因，且在中腸特異性高表達，其編碼蛋白為擁有多個跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。

圖1 基于BSA和精細定位的Vip3Aa抗性基因鑒定

通過Sanger測序，對SfCHS2分別在SS和Sfru_R3品系的基因組序列比較分析發(fā)現(xiàn)，相比于SS品系，Sfru_R3品系SfCHS2基因組序列存在長度約為6.4 Kb的大片段插入（圖2）。通過BLAST比對分析，鑒定該插入序列為長末端重復-逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（long terminal repeat retrotransposon，LTR），并將這個轉(zhuǎn)座子序列命名為Yaoer（幺蛾）。通過序列分析進一步發(fā)現(xiàn)，Yaoer的插入位點比較特殊，剛好位于21號外顯子和21號內(nèi)含子之間，且原始剪接位點序列并未受到影響。與此同時，Yaoer的插入引入了一個新的剪接位點，位于Yaoer的3’端與21號內(nèi)含子5’端之間。新引入的剪接位點，理論上會擾亂21號內(nèi)含子的正確剪切。為了驗證這個假設(shè)，研究人員通過特異性引物擴增得到的PCR產(chǎn)物以及全長轉(zhuǎn)錄組測序（Iso-Seq）分析發(fā)現(xiàn)，就exon21-intron21-exon22區(qū)間而言，SS品系SfCHS2只有一種轉(zhuǎn)錄本，即野生型轉(zhuǎn)錄本。然而，Sfru_R3品系SfCHS2卻同時擁有野生型轉(zhuǎn)錄本和多種突變轉(zhuǎn)錄本。盡管屬于不同類型的突變轉(zhuǎn)錄本，但與野生轉(zhuǎn)錄本相比，突變轉(zhuǎn)錄本均只能產(chǎn)生一種缺失了C7結(jié)構(gòu)域的不完整SfCHS2蛋白。

而且，通過RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，SfCHS2總轉(zhuǎn)錄本（total transcripts）的轉(zhuǎn)錄水平在SS和Sfru_R3之間不存在顯著性差異。然而，與SS相比，Sfru_R3品系SfCHS2野生型轉(zhuǎn)錄本（wild-type transcripts）的轉(zhuǎn)錄水平顯著性降低，只有SS的1/12。與此同時，遺傳連鎖分析結(jié)果表明，Sfru_R3品系SfCHS2野生型轉(zhuǎn)錄本的低轉(zhuǎn)錄水平與Vip3Aa抗性遺傳連鎖（圖2），暗示SfCHS2野生型轉(zhuǎn)錄本降低可能是介導Sfru_R3產(chǎn)生高水平抗性的直接原因。

圖2 Vip3Aa抗性品系SfCHS2逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入鑒定及其遺傳連鎖分析

為了驗證SfCHS2的功能紊亂能介導草地貪夜蛾對Vip3Aa產(chǎn)生高水平抗性這一假設(shè)，研究人員進一步通過基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，構(gòu)建了3個草地貪夜蛾SfCHS2敲除純合品系（SfCHS2-KO-A/B/C）。生測結(jié)果表明，3個草地貪夜SfCHS2敲除品系均對Vip3Aa表現(xiàn)出>12,000倍的高水平抗性（圖3）。同時，遺傳互補實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SfCHS2敲除品系與Sfru_R3交配后所產(chǎn)F1子代同樣對Vip3Aa擁有極高的抗性水平。該結(jié)果表明，介導Sfru_R3對Vip3Aa產(chǎn)生高水平抗性的遺傳位點與SfCHS2所在位點相一致。

圖3 CRISPR/Cas9介導的SfCHS2基因敲除及其Vip3Aa敏感性分析

在明確了Yaoer插入SfCHS2能夠介導草地貪夜蛾對Vip3Aa產(chǎn)生高水平抗性后，研究人員對來自全球540份草地貪夜蛾重測序數(shù)據(jù)進行了比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其中有1個于2020年采自廣東省江門市田間的樣本，攜帶有與Sfru_R3品系相同的SfCHS2抗性等位基因，且該個體為SfCHS2突變純合體。

此外，為了進一步明確由CHS2介導的Vip3Aa抗性機制是否存在物種特異性，研究人員同時還構(gòu)建了另外2種鱗翅目害蟲斜紋夜蛾和東方黏蟲的CHS2敲除品系，生測結(jié)果顯示，這2種鱗翅目害蟲的CHS2敲除品系分別對Vip3Aa表現(xiàn)出 >100,000和 >1,330倍的高水平抗性，暗示CHS2參與介導Vip3Aa抗性的機制可能是鱗翅目昆蟲共有的機制，同時也暗示，CHS2在Vip3Aa對不同鱗翅目害蟲作用模式中所發(fā)揮的功能具有一定程度的保守性。

綜上所述，該研究通過正向、反向遺傳學研究手段證實了CHS2能介導至少3種鱗翅目害蟲對Vip3Aa的高水平抗性。SfCHS2基因Yaoer插入事件在田間樣本的發(fā)現(xiàn)，對于田間Vip3Aa抗性的監(jiān)測和管理具有十分重要的意義。有必要對已報道的其他靶標害蟲Vip3Aa高抗品系CHS2基因進行Yaoer插入變異以及其他可能導致CHS2功能紊亂的變異檢測。同時，有必要在田間大范圍地檢測靶標害蟲是否攜帶導致CHS2功能紊亂的變異，尤其是已經(jīng)長時間種植轉(zhuǎn)Vip3Aa作物的地區(qū)。此外，結(jié)合此前相關(guān)研究表明，盡管介導靶標害蟲對Vip3Aa產(chǎn)生抗性的遺傳基礎(chǔ)可能存在多樣性，然而，相對而言，對田間靶標害蟲CHS2的變異監(jiān)測將更加重要。總而言之，該研究所得結(jié)論，對田間靶標害蟲Vip3Aa抗性管理與監(jiān)測具有里程碑式的意義，是該團隊去年報道首個Vip抗性基因（PNAS, 2023）之后的又一重要成果。

基因組所博士后劉振興、助理研究員廖重宇、博士后鄒路明、研究員靳明輝以及博士生單銀雪為論文的共同第一作者。蕭玉濤研究員、吳孔明院士和德國馬普生態(tài)所David G. Heckel教授為論文的共同通訊作者。美國科學院院士Bruce E. Tabashnik教授以及華中師范大學的劉凱于教授參與了該項研究的相關(guān)工作。該研究得到了國家自然科學基金、中國農(nóng)科院創(chuàng)新工程等項目的資助。

原文鏈接：https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3002704

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