近日,，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所（嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室深圳分中心,，以下簡稱“基因組所”）蕭玉濤團(tuán)隊在《公共科學(xué)圖書館-生物學(xué)（PLoS Biology）》在線發(fā)表了題為“Retrotransposon-mediated disruption of a chitin synthase gene confers insect resistance to Bacillus thuringiensis Vip3Aa toxin”的研究論文,。該研究發(fā)現(xiàn)了一個極為重要的Vip抗性基因,。該研究首次證實(shí),，中腸幾丁質(zhì)合成酶（Chitin synthase 2, CHS2）變異參與介導(dǎo)了草地貪夜蛾對Vip3Aa的高水平抗性,。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis, Bt）產(chǎn)生的殺蟲蛋白已被廣泛應(yīng)用于害蟲防治近一個世紀(jì),，有效保護(hù)了作物免受蟲害,。然而,，Bt作物長年大規(guī)模的種植，不可避免地導(dǎo)致靶標(biāo)害蟲對其演化出抗性,。目前,，已報道害蟲對轉(zhuǎn)Bt-Cry蛋白作物產(chǎn)生田間抗性（practical resistance）案例不低于26例，分布于7個國家,，包含11種靶標(biāo)害蟲,。為了對抗害蟲對Cry蛋白的抗性，農(nóng)民開始種植同時產(chǎn)生Cry蛋白和Vip3Aa的轉(zhuǎn)基因作物,。Vip3Aa蛋白是Bt在營養(yǎng)階段產(chǎn)生的殺蟲蛋白,，擁有較好的殺蟲功效，且與Cry蛋白的殺蟲作用模式不同,。

近年來,，鱗翅目害蟲美洲棉鈴蟲（Helicoverpa zea）和草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）對Vip3Aa具有田間抗性的早期預(yù)警已有報道,。因此，迫切需要了解靶標(biāo)害蟲對Vip3Aa產(chǎn)生抗性的遺傳基礎(chǔ),，用于田間抗性監(jiān)測和管理,。這對于全球重要入侵害蟲草地貪夜蛾尤為重要，該害蟲自2018年底由云南邊境入侵我國,，目前已將其分布范圍從美洲擴(kuò)展到非洲,、亞洲和澳大利亞。它較強(qiáng)的適應(yīng)性,、繁殖能力以及遠(yuǎn)距離遷徙能力對入侵地農(nóng)作物的安全生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。

研究人員首先采集了草地貪夜蛾田間種群,，通過室內(nèi)連續(xù)篩選,，獲得了抗性穩(wěn)定遺傳的Vip3Aa抗性品系（Sfru_R3）。生物測定結(jié)果表明,，該抗性品系擁有相對于敏感品系約5,560倍的Vip3Aa抗性,，且與Cry毒素（Cry1Ab、Cry1Ac,、Cry1Fa）不存在交互抗性,。遺傳特征分析結(jié)果表明，該抗性性狀為常染色體,、不完全隱性遺傳,，且由單遺傳位點(diǎn)控制。為了明確介導(dǎo)該抗性的遺傳基礎(chǔ),，研究人員首先構(gòu)建了F2性狀分離群體,，通過BSA（bulked segregant analysis）定位到位于1號染色體上長度約為4.4 Mb（6.56-10.92 Mb）的遺傳區(qū)間（圖1）。在此基礎(chǔ)上,，進(jìn)一步通過精細(xì)定位（fine-mapping）,，將候選遺傳區(qū)間縮小至0.75 Mb（8.17-8.62 Mb）。該候選遺傳區(qū)間內(nèi)共有19個基因被注釋,，結(jié)合這19個基因的轉(zhuǎn)錄水平及其蛋白結(jié)構(gòu),，最終將目標(biāo)基因鎖定為SfCHS2。目標(biāo)基因?yàn)閹锥≠|(zhì)合成酶基因,，且在中腸特異性高表達(dá),，其編碼蛋白為擁有多個跨膜結(jié)構(gòu)域的膜蛋白。

圖1 基于BSA和精細(xì)定位的Vip3Aa抗性基因鑒定

通過Sanger測序,，對SfCHS2分別在SS和Sfru_R3品系的基因組序列比較分析發(fā)現(xiàn),，相比于SS品系，Sfru_R3品系SfCHS2基因組序列存在長度約為6.4 Kb的大片段插入（圖2）,。通過BLAST比對分析,，鑒定該插入序列為長末端重復(fù)-逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（long terminal repeat retrotransposon,，LTR），并將這個轉(zhuǎn)座子序列命名為Yaoer（幺蛾）,。通過序列分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),，Yaoer的插入位點(diǎn)比較特殊，剛好位于21號外顯子和21號內(nèi)含子之間,，且原始剪接位點(diǎn)序列并未受到影響,。與此同時，Yaoer的插入引入了一個新的剪接位點(diǎn),，位于Yaoer的3’端與21號內(nèi)含子5’端之間,。新引入的剪接位點(diǎn)，理論上會擾亂21號內(nèi)含子的正確剪切,。為了驗(yàn)證這個假設(shè),，研究人員通過特異性引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物以及全長轉(zhuǎn)錄組測序（Iso-Seq）分析發(fā)現(xiàn)，就exon21-intron21-exon22區(qū)間而言,，SS品系SfCHS2只有一種轉(zhuǎn)錄本,，即野生型轉(zhuǎn)錄本。然而,，Sfru_R3品系SfCHS2卻同時擁有野生型轉(zhuǎn)錄本和多種突變轉(zhuǎn)錄本,。盡管屬于不同類型的突變轉(zhuǎn)錄本，但與野生轉(zhuǎn)錄本相比,，突變轉(zhuǎn)錄本均只能產(chǎn)生一種缺失了C7結(jié)構(gòu)域的不完整SfCHS2蛋白,。

而且，通過RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn),，SfCHS2總轉(zhuǎn)錄本（total transcripts）的轉(zhuǎn)錄水平在SS和Sfru_R3之間不存在顯著性差異,。然而，與SS相比,，Sfru_R3品系SfCHS2野生型轉(zhuǎn)錄本（wild-type transcripts）的轉(zhuǎn)錄水平顯著性降低,，只有SS的1/12。與此同時,，遺傳連鎖分析結(jié)果表明，Sfru_R3品系SfCHS2野生型轉(zhuǎn)錄本的低轉(zhuǎn)錄水平與Vip3Aa抗性遺傳連鎖（圖2）,，暗示SfCHS2野生型轉(zhuǎn)錄本降低可能是介導(dǎo)Sfru_R3產(chǎn)生高水平抗性的直接原因,。

圖2 Vip3Aa抗性品系SfCHS2逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入鑒定及其遺傳連鎖分析

為了驗(yàn)證SfCHS2的功能紊亂能介導(dǎo)草地貪夜蛾對Vip3Aa產(chǎn)生高水平抗性這一假設(shè)，研究人員進(jìn)一步通過基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù),，構(gòu)建了3個草地貪夜蛾SfCHS2敲除純合品系（SfCHS2-KO-A/B/C）,。生測結(jié)果表明，3個草地貪夜SfCHS2敲除品系均對Vip3Aa表現(xiàn)出>12,000倍的高水平抗性（圖3）,。同時,，遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),，SfCHS2敲除品系與Sfru_R3交配后所產(chǎn)F1子代同樣對Vip3Aa擁有極高的抗性水平。該結(jié)果表明,，介導(dǎo)Sfru_R3對Vip3Aa產(chǎn)生高水平抗性的遺傳位點(diǎn)與SfCHS2所在位點(diǎn)相一致,。

圖3 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的SfCHS2基因敲除及其Vip3Aa敏感性分析

在明確了Yaoer插入SfCHS2能夠介導(dǎo)草地貪夜蛾對Vip3Aa產(chǎn)生高水平抗性后，研究人員對來自全球540份草地貪夜蛾重測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了比對分析,，結(jié)果發(fā)現(xiàn),，其中有1個于2020年采自廣東省江門市田間的樣本，攜帶有與Sfru_R3品系相同的SfCHS2抗性等位基因,，且該個體為SfCHS2突變純合體,。

此外，為了進(jìn)一步明確由CHS2介導(dǎo)的Vip3Aa抗性機(jī)制是否存在物種特異性,，研究人員同時還構(gòu)建了另外2種鱗翅目害蟲斜紋夜蛾和東方黏蟲的CHS2敲除品系,，生測結(jié)果顯示，這2種鱗翅目害蟲的CHS2敲除品系分別對Vip3Aa表現(xiàn)出 >100,000和 >1,330倍的高水平抗性,，暗示CHS2參與介導(dǎo)Vip3Aa抗性的機(jī)制可能是鱗翅目昆蟲共有的機(jī)制，同時也暗示,，CHS2在Vip3Aa對不同鱗翅目害蟲作用模式中所發(fā)揮的功能具有一定程度的保守性,。

綜上所述，該研究通過正向,、反向遺傳學(xué)研究手段證實(shí)了CHS2能介導(dǎo)至少3種鱗翅目害蟲對Vip3Aa的高水平抗性,。SfCHS2基因Yaoer插入事件在田間樣本的發(fā)現(xiàn)，對于田間Vip3Aa抗性的監(jiān)測和管理具有十分重要的意義,。有必要對已報道的其他靶標(biāo)害蟲Vip3Aa高抗品系CHS2基因進(jìn)行Yaoer插入變異以及其他可能導(dǎo)致CHS2功能紊亂的變異檢測,。同時，有必要在田間大范圍地檢測靶標(biāo)害蟲是否攜帶導(dǎo)致CHS2功能紊亂的變異,，尤其是已經(jīng)長時間種植轉(zhuǎn)Vip3Aa作物的地區(qū),。此外，結(jié)合此前相關(guān)研究表明,，盡管介導(dǎo)靶標(biāo)害蟲對Vip3Aa產(chǎn)生抗性的遺傳基礎(chǔ)可能存在多樣性,，然而，相對而言,，對田間靶標(biāo)害蟲CHS2的變異監(jiān)測將更加重要?？偠灾?，該研究所得結(jié)論，對田間靶標(biāo)害蟲Vip3Aa抗性管理與監(jiān)測具有里程碑式的意義,，是該團(tuán)隊去年報道首個Vip抗性基因（PNAS, 2023）之后的又一重要成果,。

基因組所博士后劉振興、助理研究員廖重宇,、博士后鄒路明、研究員靳明輝以及博士生單銀雪為論文的共同第一作者,。蕭玉濤研究員,、吳孔明院士和德國馬普生態(tài)所David G. Heckel教授為論文的共同通訊作者,。美國科學(xué)院院士Bruce E. Tabashnik教授以及華中師范大學(xué)的劉凱于教授參與了該項(xiàng)研究的相關(guān)工作,。該研究得到了國家自然科學(xué)基金、中國農(nóng)科院創(chuàng)新工程等項(xiàng)目的資助,。

原文鏈接：https://journals.plos.org/plosbiology/article?id=10.1371/journal.pbio.3002704

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