“生活總是充滿驚喜，正是因為這樣,，未來才充滿期待，生活如此,，科研也是如此”，常玉曉感嘆地說,，F(xiàn)BI-seq的研發(fā)成功源自實驗室的一次“不完美”,，這次意外之喜也讓他意識到也許并不存在所謂的“不完美”，如果換一種角度,，“不完美”也可以變得完美,。

近日，基因組所聯(lián)合南京農(nóng)業(yè)大學等單位成功開發(fā)出低成本全基因組基因分型技術FBI-seq（Foreground and Background Integrated genotyping by sequencing）,，該技術可同時檢測育種材料的前景基因和遺傳背景,，大大節(jié)省了育種成本,，提高了育種效率，是一種全新的全基因組基因分型技術,。該技術有望在作物品種鑒別,、種質資源鑒定、遺傳圖譜構建,、親緣關系推測等方面中發(fā)揮重要作用,。相關研究成果在線發(fā)表在《植物學報（Journal of Integrative Plant Biology）》（下拉至文章底部，掃描二維碼可獲取電子版文獻）,。

原文鏈接：https://www.jipb.net/EN/10.1111/jipb.13395

“搜索”的“困境”

在日常工作學習中,，你有沒有過這樣的煩惱：比如你想起一句歌詞或是一段旋律，卻忘記了歌名,，只依稀記得歌詞里有“朝陽”兩字,，于是你在歌庫中輸入關鍵詞“朝陽”，卻搜索出了上千條含有“朝陽”的歌,，一首一首聽是不太可能的,，你只得增加關鍵詞的長度,，例如：“一杯敬朝陽”“”或者換一個關鍵詞比如“毛不易”,，于是你找到了這首歌，是毛不易的《消愁》,。

我們無時無刻不在搜索,，但如何又快又準地找到我們想要的東西？

這是我們生活中的困擾,，也是擺在科研人員面前的一道難題,。

把基因組當成一個數(shù)據(jù)庫或者一個word文檔，里面充斥著“A”“G”“C”“T”的字符,，當你想要找出或復制某一特定基因片段的序列時,，往往將基因片段的15-20位序列作為關鍵詞進行搜索。

然而,，由15-20位字符組成的序列有時候并不“特異”,，總是會得到多個相似的搜索結果，以至于我們不得不往后或往前再延長幾位,，以確保我們搜索到的結果就是我們想要的,。

在生物學里，我們把由20位字符組成的序列叫做“引物”,，把特定的基因片段叫做“目的基因”,。

生物育種的第一步就是篩選出目的基因，又叫做前景基因選擇,，目前,，最常用的方法是基于PCR的分子標記方法,。

簡單來說，基于PCR的分子標記方法是通過特異性引物進行PCR擴增及建庫測序,，然而在這一步中受實驗條件或引物影響,，大多數(shù)人都會受到彌散條帶（smear）或多個條帶的影響，又稱PCR的非特異性擴增現(xiàn)象,，這一現(xiàn)象讓不少人頭疼不已,，極力避之，然而,，常玉曉卻決定反其道而行之,。

變“廢”為“寶”

這一發(fā)現(xiàn)來源于實驗室的一次“不完美”，常玉曉的研一學生在設計PCR引物時,，錯誤理解了導師的實驗思路,，操作失誤導致實驗結果很不“理想”，學生雖然感到很沮喪,，卻又不得不硬著頭皮將這一結果報告給常玉曉,。而常玉曉卻在其中發(fā)現(xiàn)了秘密。他讓學生將實驗數(shù)據(jù)深入分析后意外地發(fā)現(xiàn),，學生“不完美”的實驗卻帶來了遠遠高于期望值的“超完美”結果,，而產(chǎn)生“超完美”結果的根本原因，正是一直被大家視為“噪音”和“垃圾”的PCR引物與DNA模板之間不完美匹配（primer-template mismatched annealing, PTMA）引發(fā)的非特異性擴增,。

當一條長度為20個堿基的引物與基因組配對時,，若只有7-8個堿基的完美匹配、剩余的堿基全部是不完美匹配,，這時,，通過優(yōu)化PCR的反應體系（如試劑組成、退火溫度,、循環(huán)數(shù)）可以增強非特異性擴增的產(chǎn)生,！

常玉曉恰恰是利用這一意外發(fā)現(xiàn)，將“不完美”的匹配轉換為“完美”的結果,！

他們基于這一發(fā)現(xiàn)開發(fā)的FBI-seq（Foreground and Background Integrated genotyping by sequencing,，圖1），利用引物與模板間的PTPA擴增檢測前景基因,，利用引物與模板間的PTMA擴增檢測遺傳背景,，因此，F(xiàn)BI-seq可實現(xiàn)同時檢測前景基因和遺傳背景,！

圖1 | FBI-seq技術路線及數(shù)據(jù)特征

為了驗證FBI-seq技術對不同前景基因的檢測效果,，研究團隊隨機選擇了水稻中稻瘟病抗性基因Pi2和粒長基因qGL3等共6個前景基因，分別設計引物進行文庫構建及測序,，數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)通過引物的PTPA擴增可準確覆蓋這些前景基因位點,，同時基于全基因組范圍內(nèi)的PTMA擴增也獲得了數(shù)以萬計的tag位點,，因此FBI-seq中的PTPA和PTMA擴增特性可成功應用于其他不同前景基因引物。隨后,，研究團隊又分析了多個水稻品種的不同技術重復間可重復鑒定到的tag的數(shù)量和分布位置,，以及不同抽樣數(shù)據(jù)量下tag數(shù)目的變化特征，進一步驗證了PTMA擴增的穩(wěn)定性,。

為了探究FBI-seq在育種中的實際應用效果,，研究團隊選擇了一個水稻BC(2)F(4)群體進行驗證。利用結合在稻瘟病抗性基因Pi2位點的SP引物,，對隨機選擇的5個單株進行FBI-seq文庫構建及測序,，根據(jù)覆蓋深度及穩(wěn)定性獲得了三類SNP，基于三類SNP分別獲得的binmap圖譜以及PTPA擴增結果,，發(fā)現(xiàn)5個測試單株均含Pi2抗性基因,，遺傳背景回復率在83.8~93.0%之間（圖2）。最后,，研究團隊測試了源于水稻的多個SP引物在西紅柿和豇豆中的基因分型效果,，發(fā)現(xiàn)PTMA擴增產(chǎn)生的穩(wěn)定tag位點在這兩個物種的全基因組上均可均勻分布，說明FBI-seq在其他物種中也有很好的基因分型能力,。

圖2 | FBI-seq對水稻育種群體進行前景基因和遺傳背景檢測

FBI-seq技術是常玉曉課題組繼AIO-seq測序技術開發(fā)之后的又一重要研究成果,。FBI-seq的成功開發(fā)，不僅實現(xiàn)了作物育種中前景基因和遺傳背景的同時檢測,，節(jié)省了育種成本,，提高了育種效率,；同時,，作為一種新的全基因組基因分型技術，F(xiàn)BI-seq也有望在各種作物的真假品種鑒別,、種質資源鑒定,、遺傳圖譜構建、親緣關系推測等領域中發(fā)揮重要作用,。

基因組所常玉曉研究員,、錢前院士和南京農(nóng)業(yè)大學智海劍教授為本論文通訊作者。本項目得到國家自然科學基金,、江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心等項目的資助,。

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參考文獻

1. Sheng Zhao#, Cuicui Zhang#, Liqun Wang#, Minxuan Luo, Peng Zhang, Yue Wang, Waqar Afzal Malik, Yue Wang, Peng Chen, XianjinQiu, Chongrong Wang, Hong Lu, Yong Xiang, Yuwen Liu, JueRuan, Qian Qian*, HaijianZhi*, Yuxiao Chang*. A prolific and robust whole-genome genotyping method using PCR amplification via primer-template mismatched annealing, Journal of Integrative Plant Biology, 2022, DOI: 10.1111/jipb.13395.

2. Sheng Zhao#, Cuicui Zhang#, Jiangqiang Mu, Hui Zhang, Wen Yao, Xinhua Ding, Junqiang Ding*, Yuxiao Chang*. All-in-one sequencing: an improved library preparation method for cost-effective and high-throughput next-generation sequencing, Plant Methods, 2020, 16: 74.